Proteinlerin Yapısı ve Biyoteknolojik İlaçlar

Biyoteknoloji canlı sistemleri ve biyolojik süreçleri, yararlı ürünler üretmek veya sorunları çözmek için kullanan çok disiplinli bilim ve teknoloji dalıdır. Biyoteknolojik ilaçlar ise rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak canlı organizmalarda üretilen makromoleküllerdir. Ulusal ve uluslararası kılavuzlarda biyolojik ilaç veya biyofarmasötik olarak da adlandırılırlar. Sitokinler, enzimler, hormonlar, pıhtılaşma faktörleri, monoklonal antikorlar, hücresel tedavi ürünleri, antisens oligonükleotitler ve terapötik peptitler olarak gruplandırılırlar. Biyoteknolojik ilaçlar ile ilgili süreç geliştirme, karakterizasyon, üretim ve ruhsatlandırma konuları farmasötik biyoteknoloji bilim dalı içerisinde tüm bilimsel ve teknolojik yönleri ile ele alınmaktadır. Bunlar dışında bir de yapıları nedeniyle kimyasal ve biyolojik ilaç arasında kalan sentetik peptitler vardır. Bu peptitlere yazının devamında göz atabilirsiniz.

Aşağıdaki tabloda (tablo 1) kimyasal ve biyolojik ilaçların farkları sıralanmıştır.

Kimyasal İlaçlar	Biyoteknolojik İlaçlar
- Küçük moleküllerdir. - Basit yapılıdırlar. - Serum proteazlarına karşı dayanıklıdırlar. - Stabilite sorunları yoktur. - İyi tanımlanmış modifikasyonlardır. - Kimyasal sentez ile elde edilir. - Üretimde kritik işlem basamağı azdır. - Bütünüyle karakterize etmek kolaydır. - İmmünojenik değildir.	- Küçük ve büyük karmaşık moleküllerdir. - Serum proteazlarına karşı duyarlıdırlar. - Stabilite sorunları vardır. - Modifikasyon seçenekleri fazladır. - Canlı hücrelerden elde edilir. - Üretimde kritik işlem basamağı çoktur. - Bütünüyle karakterize etmek imkansızdır. - Genellikle immünojeniktir.

Biyoteknolojik ilaçlar, gastrointestinal kanalda enzimatik olarak parçalanmaları, çok büyük moleküllü olmaları ve membranlardan geçişlerinin düşük olması gibi dezavantajlara sahiptirler. Bu yüzden ağız yoluyla alınmazlar, genellikle enjeksiyon yoluyla verilirler. Ayrıca, büyük ve dayanıksız moleküller olmaları, plastik yüzeylere adsorbe olmaları, ısıya, ışığa ve seyrelticilere, karıştırmaya, sürtünmeye ve basınca duyarlı olmaları, katkı maddeleri ile geçimsizlik gösterebilmeleri ve köpük oluşumuna bağlı kayba uğramaları sebebiyle formülasyonları zordur ve kimi zaman kontrollü salım sistemiyle formüle edilmeleri gerekir.

Bütün bu dezavantajlarına rağmen biyoteknolojik ilaçların tercih edilmesinin sebepleri arasında yüksek spesifik aktivite göstermeleri, diğer sentetik ilaçlara göre daha az ve tolere edilebilir yan etkiye sahip olmaları ve çok az dozlarda bile etkili olmaları sayılabilir. Diğer yandan 50 amino asit büyüklüğe kadar olan peptitlerin kimyasal yöntemlerle sentezlenebilmesine karşın daha büyük proteinlerin eldesi için rekombinant DNA teknolojisinin kullanımı kaçınılmazdır.

Peptit ve protein yapısındaki etkin maddeler, rekombinant DNA teknolojisiyle elde edilebildiği gibi doğrudan biyolojik ortamlardan saflaştırılarak da üretilebilir. Biyolojik ortamlardan saflaştırılan proteinlerin immünojenitesi, rekombinant proteinlere göre daha yüksektir.

Proteinlerin Yapısı

Peptitler, amino asitlerden oluşmuş zincirlerdir. İki amino asit molekülü bir amit bağı ile kovalent olarak birbirine bağlandıklarında bir dipeptit oluşur. Genellikle 8 ve üzeri amino asitten oluşan peptitler oligopeptit, 20 ve üzeri amino asitten oluşan peptitler ise polipeptit olarak adlandırılır. Üç boyutlu yapıya katlanarak bir fonksiyon gösteren polipeptitlere protein adı verilir.

Proteinler birincil, ikincil, üçüncül ve dördüncül olmak üzere 4 farklı konformasyonel yapıya sahiptir. Birincil yapı, proteinin amino asit dizilimidir; proteinin yapısını ve kimyasal davranışını ifade eder. İkincil yapı alfa-heliks ve beta-yaprak olmak üzere hidrojen bağlarıyla bağlı, birbirini tekrar eden düzenlemelerdir. Üçüncül yapı, ikincil yapıların üç boyutlu katlanmasıyla oluşur ve proteinlerin biyolojik aktivitesini ifade eder. Dördüncül yapı, birden fazla amino asit zincirinin bir arada bulunmasıyla oluşur.

DNA üzerindeki genetik bilginin mRNA’ya yazılımı (transkripsiyon) ve mRNA’daki bilginin çevrilmesi (translasyon) sonucu protein sentezi gerçekleşir. MRNA üzerindeki bilginin proteine çevrilmesi sürecinde veya sonrasında proteinlerde önemli etkileri olan kimyasal modifikasyonlar meydana gelir. Bunlara post translasyonel modifikasyonlar denir.

Bu modifikasyonların fonksiyonel proteomikste önemli rolü vardır. Her protein fonksiyonel değildir. Bazı proteinlerin biyolojik aktivite gösterebilmesi için post translasyonel modifikasyona uğraması gerekir. Bu modifikasyonların çeşidi ve sıklığı proteinden proteine farklılık gösterir. Proteinler 100 farklı post translasyonel modifikasyona uğrar. Glikozilasyon gibi bazı modifikasyonlar sık gözlenirken, selenizasyon gibi bazı modifikasyonlar nadiren gözlenir. Fosforilasyon gibi bazıları geri dönüşümlü iken, proteoliz gibi bazıları ise geri dönüşümsüzdür.

Rekombinant protein üretimi sırasında üretimde kullanılan hücre hattı, üretim koşulları (sıcaklık, büyüme oranı, besi yeri bileşenleri) ve saflaştırma işlemi post translasyonel modifikasyon özelliklerini etkileyen faktörlerdir. Post translasyonel modifikasyonların önemli etkileri arasında proteinlerin doğru katlanması, hedeflenmesi, hücre içi trafiğinin sağlanması (hücre dışı salgılanma veya hücre içi organele yönelme), biyolojik aktivitesi, stabilitesi, yarılanma ömrünün düzenlenmesi, immünojenisitesi, ligand tanınması ve bağlanması sayılabilir.

Biyoteknolojik İlaçların Kontrollü Salımı

Biyoteknolojik ilaçların gastrointestinal kanalda proteolitik parçalanmaya uğradıklarından söz etmiştik. Ayrıca bu ilaçlar bulunmaları gereken miktarın çok üzerinde uygulandıkları için toksik etkiler gösterebilmektedir. Absorbsiyonlarının düşük olması, ilk geçiş etkisine ve karaciğer enzimleri ile yıkıma uğramaları ve kan dolaşımında yarılanma ömürlerinin kısa olması da rekombinant peptit ve proteinleri kontrollü salım için uygun aday moleküller haline getirmektedir.

Kontrollü salım sistemleri bir etkin maddeyi belirli bir zaman diliminde ve önceden kararlaştırılmış bir hızla salan taşıyıcılardır. Etkin maddeyi etki yerine hedeflemek üzere hazırlanan sistemler ile hastanın uygulanan tedaviye uyum sağlayabilmesi veya absorbsiyonu artırmak üzere farklı yollardan uygulanmak üzere hazırlanan sistemler de kontrollü salan sistemler içerisinde ele alınır.

Polimerik mikro ve nanopartiküller, lipit yapıda lipozom, emülsiyon ve jel yapıdaki formülasyonlar içerisinde biyoetkin maddeler hapsedilerek veya tutturularak kontrollü sistemler oluşturulabilir. Proteinlerin metabolik enzimler tarafından parçalanmasını önlemek ve vücutta kalış süresini arttırmak için polietilen glikol (PEG) ile kovalent bağlanarak modifikasyonu da kontrollü salım amacına uygun olarak çalışılmakta olan bir yöntemdir ve bu yolla elde edilen konjugatlar ile biyoyararlanım artmakta, antijenik ve toksik etkiler azaltılabilmektedir.

Peptit ve proteinlerin kontrollü salımında kullanılan polimerlerin de hidrofobikliği artırılarak en duyarlı proteinler için bile erozyon hızı kolayca ayarlanabilen ve tam koruma sağlayan sistemler geliştirilebilir.

Gen tedavisinde ise kontrollü salım zorunludur. Gen tedavisi ex vivo ve in vivo olmak üzere iki şekilde yapılmaktadır. Ex vivo tedavide hasta dokular canlı dışına alınıp in vitro kültürleri yapıldıktan sonra bozuk genler onarılarak canlıya yeniden nakledilir. In vivo tedavide ise hastalıklı bölgelere doğru çalışan genler kontrollü salan sistemler içerisinde uygulanır.

DNA veya RNA’nın hedef hücreye taşınması için nükleazlardan korunması gerekir. Viral veya viral olmayan taşıyıcılar transfeksiyon veya transdüksiyon ile gen aktarımını sağlar. Ekspresyonun başarılı olabilmesi için DNA çekirdeğe, RNA sitoplazmaya varmalıdır. Aşırı negatif yüklü ve büyük moleküllü DNA ve RNA, yerine ulaşması için pek çok engeli aşması gerekir.

DNA’nın taşıyıcı sisteme yüklenmesinde en fazla etkili olan mekanizma elektriksel etkileşimlere dayalı olan bağlanmadır. DNA’nın aşırı negatif yükü nedeniyle katyonik özellikte lipit, protein veya yüzey etkin maddelere bağlanması sağlanır. Taşıyıcı sisteme hücre yüzeyine özgü reseptöre bağlanabilen ligantlar tutturulabilir veya gen açma kapama sistemi olarak tanımlanan yapılanmalarla seçici ilerletici (promotör genler) kullanılarak terapötik genin hedef hücrede seçici ekspresyonu sağlanabilir. Bu sistemlerde küçük moleküllü bir ilaç, geni etkinleştirerek ekspresyonun olmasını sağlar, ilaç olmazsa gen çalışmaz ve sistem durur. Gen açma kapama sistemleri geliştirilerek dokuya özgü bir ilerletici ile dokuya özel ilaç kontrollü transgen ekspresyon sistemleri hazırlanabilir.

Gen tedavisi amacıyla antisens oligonükleotitler de kullanılabilir. Oligonükleotitler gen ekspresyonunu doğrudan etkileyen kısa DNA veya RNA dizileridir. Antisens oligonükleotitler, bir genin ifade edilmesini o geni bloke ederek engelleyebilen, mRNA ile eşleşmiş küçük nükleik asit dizileridir ve viral hastalıkların ve onkogenlerin ekspresyonunun kontrolünde kullanılırlar. Burada da en önemli sorun yine nükleazlarla parçalanmalarıdır. Lipoproteinlere tutturularak uygulanan antisens oligonükleotitler ile parçalanma azalmış ve plazma yarı ömrü uzatılmıştır. PLGA ile hazırlanan mikrokürelerin de salımı uzattığı ve nükleaz degredasyonunu engellediği bulunmuştur.

Biyoteknolojik İlaçların Üretimi

Biyoteknolojik ilaçlarla ilgili bir diğer sorun ise üretimdir. Üretimdeki her basamak çok kritiktir ve üretim sürecinin herhangi bir aşamasında meydana gelebilecek değişiklikler üründe farklılıklara neden olur. Biyoteknolojik ürünlerde kritik işlem parametrelerinin başlangıçta belirlenmesi ve üretimin “İyi Üretim Uygulamaları (GMP)” kuralları çerçevesinde yapılması gerekir.

Gen teknolojisindeki gelişmeler ile genlerin hücreler içerisine aktarımı mümkün olabilmektedir. Biyoteknolojik ilaçların üretiminde kullanılan gen klonlama sistemi, DNA’yı taşıyan ve kendini eşleyip çoğalabilmesini sağlayan bir ekspresyon vektörü ve vektörün kendini eşleyip çoğalabildiği ekspresyon sisteminden (konakçı hücreden) oluşmaktadır.

Rekombinant protein üretim basamakları aşağıdaki gibidir.

İstenen farmasötik proteini üretebilecek hedef gen dizisi seçilir ve çoğaltılır. Hedef gen dizisi ve ekspresyon vektörü aynı restriksiyon enzimi ile kesilir. Hedef gen dizisi ekspresyon vektörüne klonlanarak rekombinant DNA oluşturulur. Rekombinant plazmit DNA konakçı hücre içerisine aktarılır. Konakçı hücre, bakteri hücresi ise aktarım işlemi “transformasyon” memeli hücresi ise “transfeksiyon” olarak adlandırılır. Hedef proteinin ekspresyonu için pozitif klon içeren hücreler çoğaltılarak ana hücre bankası ve çalışma hücre bankası hazırlanır. Ekspresyon vektörlerinde antibiyotiklere karşı direnç sağlayan seçici belirteç gen bulunur. Bu antibiyotik direnç genlerinin bulunduğu plazmit DNA içeren hücreler antibiyotikli büyüme ortamında çoğalır, içermeyenler ise çoğalamaz. Hücre bankalarından hareketle, uygun üretim koşullarında fermantasyon ile hedef rekombinant proteinin ekspresyonu sağlanır. Ekspresyonu yapılmış hedef rekombinant protein saflaştırılır ve stabilitesinin sağlanması için uygun formülasyon geliştirilir. Formülasyonu yapılmış proteinin hedeflenen konsantrasyonda primer ambalaj materyaline dolumu sağlanarak; rekombinant protein ilaç elde edilir.

Ekspresyon vektörü, hedeflenen gen parçasıyla birlikte maksimum gen ekspresyonunu sağlayabilmek için çevrilme ve yazılım sinyalleri gibi önemli düzenleyici diziler içeren klonlama vektörüdür. Uygun konakçı hücrede kendilerini eşleyip çoğalabildikleri gibi, yabancı DNA parçasının kendisini eşleyip çoğalabilmesini de sağlarlar.

Ekspresyon sistemi ise üretimi yapılması istenen rekombinant proteine ait gen dizisini içeren ekspresyon vektörünün kendisini eşleyip çoğalabildiği konakçı hücredir. Prokaryotik hücreler, mayalar, memeli hücreleri, böcek hücreleri, transgenik hayvanlar ve transgenik bitkiler konakçı hücre olarak kullanılabilir. Konakçı hücre seçiminde ekspresyonu yapılması istenen proteinin özellikleri önem taşır çünkü konakçı hücre protein ürününün özelliklerini belirler.

Biyofarmasötiklerde üretim süreci ürünün kendisidir. Aynı ürünün üretiminde dahi, her üretim serisinde birbirine benzer ancak birbirinden farklı ürünler oluşur. Üretimde kullanılan ekspresyon vektörleri, hücre hattı, üretim koşulları (sıcaklık, büyüme oranı, besi yeri bileşenleri, ortam pH’ı) ve saflaştırma işlemi gibi üretim sürecine ait üst akım ve alt akım işlemlerindeki parametreler; proteinin konformasyonel yapısını, post translasyonel modifikasyonlarını, safsızlık seviyesini ve çözünürlüğünü değiştirir. Kültür ortamı ve hücre büyümesi şartları proteinin glikozilasyonunu, glikozilasyon derecesi de proteinin etkililiğini ve güvenliliğini değiştirir. Ürün ya da üretim işlemi kaynaklı safsızlıklar ve post translasyonel modifikasyonlar da ürünün immünokimyasal özelliğini etkiler.

Sonuç olarak biyofarmasötikler her aşaması kritik bir üretim sürecine sahip olması ve zor formüle edilmesi gibi dezavantajlarına rağmen yüksek spesifik aktivite göstermeleri, daha az yan etki göstermeleri ve kimyasal yolla üretimi mümkün olmayan büyük ve karmaşık proteinlerin bu yolla üretiminin mümkün olması gibi avantajları nedeniyle geleceğin ilaç teknolojisi olarak görülmektedir.

Kaynaklar ve İleri Okuma

1- İskit, Alper B. vd. Biyoteknolojik İlaçlar (Biyolojik ve Biyobenzer Ürünlerin Üretimi, Kalitesi, Preklinik – Klinik Çalışmaları ve Güvenliği. Araştırmacı İlaç Firmaları Derneği (AIFD) 3. Basım, Şubat 2021.

2- Zırh, Ayla (ed.). Kontrollü Salım Sistemleri. İstanbul: Kontrollü Salım Sistemleri Derneği, 2. Baskı, 2014.

3- TAMER, S. İ. (2016). Biyoteknolojik İlaçlar, Genel Bakış. Turkiye Klinikleri J Pharm Sci, 5(2), 77-92.

4- SEZGİN BAYINDIR, Z., & YÜKSEL, N. Pegilasyon: PEG konjugatlarının hazırlanması ve uygulamaları.

5- Görseller: biyoteknolojikilaclar.net